world-weather.ru/pogoda/russia/saratov/
Погода в Перми

Геномные изменения человеческих эмбрионов – шаг вперед

Ученые работали над коррекцией гена, вызывающего гипертрофическую кардиомиопатию

Это отдельный тип генетически-опосредованных заболеваний, которые называются аутосомно-доминантными (обозначаются большой буквой "А" в генотипе Аа, то есть все пациенты являются гетерозиготами, гомозиготы "АА" чаще всего умирают еще в детстве). Такие болезни как правило проявляются в репродуктивном возрасте, поэтому их доля в популяции человека достаточно высока.

Соответственно, когда один из родителей страдает заболеванием, вероятность появления нездорового ребенка: Аа x аа = 50% Аа (больной) на 50% аа (здоров). Шансы на неудачу достаточно высоки, поэтому родители вынуждены обращаться за помощью в клинику репродуктивной медицины, где выполняют оплодотворение в пробирке и выбирают здоровые эмбрионы среди 50% "аа". Стараниями ученых доля здоровых "аа" эмбрионов в пробирке выросла из природных 50 до целых 74.2 процентов. НО!

В ходе эксперимента они сделали несколько очень важных наблюдений.

  1. В половых клетках (гаметах) и раннем эмбрионе гомологичная рекомбинация значительно эффективнее, чем во "взрослых" (соматических) клетках. Это отличная новость, поскольку именно этот тип рекомбинации нужен для направленного исправления ошибок в генах.

CRISPR-Cas9 работает по принципу: не разобьешь яйца – не пожаришь яичницу. Сначала Cas9 протеин находит мутацию в клеточной ДНК с помощью проводниковой РНК молекулы (sigle guide RNA, sgRNA), которая соединяется с мутированным местом по принципу комплементарности. Затем Cas9 разрезает спираль ДНК, образуя так называемый двухцепной разрыв. В дальнейшем клетка реагирует на поломки с привлечением ферментов репарации – белков, которые собирают цепь ДНК вместе.

Существует два пути, при помощи которых клетка это делает. Первый – быстрый и неточный, называется негомологическим соединением концов(NHEJ). В результате такого "соединения вслепую" соединенный сегмент ДНК имеет мелкие мутации, которые полностью выводят из строя белок, кодируемый этим геном. Понятное дело, что терапевтическая ценность этого механизма – нулевая.

Напротив, второй путь – гомологическая рекомбинация (HDR) – требует больше времени, но исправляет разрыв идеально без швов. HDR требует наличия ДНК-шаблона, содержащего информацию, необходимую для такой высокоточной работы. Поэтому исследователи вводят в клетку специальный ДНК фрагмент (искусственную матрицу) рядом с Cas9 энзимом и проводниковой РНК, если хотят починить определенный ген.

Проблема заключается в том, что в клетках здорового взрослого человека эффективность неточного пути репарации (NHEJ) значительно преобладает. Но оказывается, что в яйцеклетке полно HDR энзимов, которые тщательно следят за целостностью ДНК будущего ребенка. Ученым остается только привести эти системы на нужную мутацию с помощью CRISPR-Cas9, а дальше клетка все делает сама в лучшем виде. Интересно, что в большинстве исправленных эмбрионов мутантный аллель "А", который нес сперматозоид, был замещен здоровым геном "а", который находился на материнской хромосоме. То есть яйцеклетки / зиготы часто игнорировали искусственную матрицу, введенную учеными, и предпочитали естественный путь устранения ошибок в ДНК.

  1. Вводить Cas9 нужно вместе со сперматозоидом, когда яйцеклетка находится на стадии метафазы второго мейоза. Такой подход гарантирует, что исправление мутантного аллеля состоится еще до того, как зигота начнет делиться (войдет в стадию дробления). Это в свою очередь сводит на нет возможность возникновения мозаицизма: Ситуации, когда исправление произошло лишь в части клеток эмбриона, а остальные клеток остались мутантными. Понятно, что мозаицизм абсолютно недопустим, если мы хоть как-то намекаем на потенциальное клиническое применение технологии. Поэтому, по результатам исследования возникает четкая стратегия избегания этого неприятного явления. На самом деле, мозаицизм эмбрионов составил серьезную помеху для CRISPR-Cas9 на пути в клинику, и теперь это препятствие, кажется, позади.

Но несмотря на такие обнадеживающие результаты, традиционно остаются вопросы, на которые надо ответить, прежде чем эмбриональная инженерия станет рутинной медицинской процедурой.

Во-первых, что делать с генетическими заболеваниями, которые не являются аутосомно-доминантными?

Эмбрионы (и в дальнейшем люди) с рецессивными болезнями имеют генотип "аа", то есть гомозиготами. В такой клетке нет здорового аллеля "А", который мог бы заменить больной аллель "а". Вместе с наблюдением, что яйцеклетка неохотно использует искусственную матрицу, это означает, что семьи, где оба родителя страдают заболеваниями (Генотип "аа"), до сих пор не имеют шансов на здоровое потомство.

Во-вторых, что делать с остальными 25.8% эмбрионов, у которых заглаживание прошло неточным (NHEJ) путем, как свести этот показатель до 0%? Сейчас существуют экспериментальные подходы как блокировать NHEJ на время проведения генетической манипуляции, но все они основаны на применении химических веществ (ингибиторов). Однако травить зародыш на ранних стадиях развития химикатами, пожалуй, не лучшая идея.

В-третьих, в CRISPR-Cas9 технологии есть один общий недостаток, который касается не только эмбриональной инженерии — это неспецифическое действие. На самом деле, наведение Cas9 энзима на целевой ген с помощью проводниковой РНК, работающий на принципе сжигания комплементарных нуклеотидов, является наиболее точным и эффективным методом, но и он иногда ведет к сбоям. Авторы данного исследования подтвердили отсутствие так называемых позиционных эффектов (Off-target effects) двумя независимыми методами во всех эмбрионах с желаемым генотипом "аа". Но это скорее можно считать удачей, поскольку неспецифичность Cas9 сильно отличается между экспериментами и часто ее очень сложно, и даже невозможно предусмотреть. В этом направлении также интенсивно ведутся исследования, поэтому будем надеяться, что со временем технология действительно станет достаточно эффективна и безопасна для ее применения в клинике.
 

Источник
www.km.ru
22.03.2021
Источник: www.km.ru

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

обновлен16.04.2021 @ 22:30 всего25,440,сейчас 4 Яндекс.Метрика Top.Mail.Ru